Aquí presentamos la traducción de un artículo de Harvey Alter, uno de los premiados, que lo escribió en primera persona y publicó en Nature en 2000, explicando sus investigaciones desde los años 60 del siglo XX.

La historia que ha merecido el Premio Nobel de Medicina en 2020.

Una perspectiva de 30 años sobre la casi erradicación de la hepatitis postransfusional.

La historia que relataré aquí rastrea la erradicación casi total de la hepatitis asociada a transfusiones a lo largo de tres décadas. Quizás yo soy el hilo que une estos eventos, pero la historia ha sido tejida por muchos colaboradores que jugaron papeles esenciales y por el ambiente propicio del programa intramuros de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, en sus siglas en inglés) que propició estas investigaciones clínicas.

La historia y mi carrera investigadora comenzaron a principios de la década de 1960 cuando, como Asociado Clínico de los NIH, investigué las causas no celulares de las reacciones febriles a las transfusiones mediante la detección de anticuerpos contra las proteínas del suero en pacientes con múltiples transfusiones mediante difusión en gel de agar. Las planchas de Ouchterlony estaban apiladas en mi mesa de laboratorio, como están hoy los manuscritos no leídos. Un día, Richard Aster me dijo que había escuchado una interesante conferencia de Baruch Blumberg, quien estaba usando una metodología similar para investigar los polimorfismos de proteínas. Hablé con Blumberg y comencé una colaboración que en un año descubrió una inusual línea de precipitina resultante de la reacción entre los sueros de un paciente con hemofilia y un aborigen australiano. La línea era atípica ya que se tiñó sólo débilmente con tintes lipídicos, en contraste con los polimorfismos de lipoproteínas que se estaban estudiando entonces. Debido a que se tiñó de rojo con la contratinción de azocarmín, inicialmente lo llamamos antígeno rojo, luego debatimos llamarlo antígeno Bethesda y finalmente lo llamamos antígeno Australia, según la nomenclatura en evolución para los nuevos descubrimientos de hemoglobina.

Investigaciones posteriores mostraron que la prevalencia del antígeno Australia es sólo del 0,1% en la población de donantes, pero muy alta (10%) en pacientes con leucemia. La primera publicación sobre el antígeno Australia, citó en el título esta asociación con la leucemia. Consideramos que el antígeno podría ser un componente del virus de la leucemia, teoría que se contempló hace años. En retrospectiva, el antígeno simplemente reflejó la alta exposición a la transfusión y el estado inmunodeprimido de estos pacientes. Mi primera publicación inicial fue la caracterización biofísica del antígeno Australia.

En 1964, dejé los NIH para completar mi formación en medicina interna y hematología, y Blumberg se trasladó al Instituto de Investigación del Cáncer en Filadelfia, donde continuó insistiendo en la importancia de seguir las investigaciones sobre el antígeno Australia. Tanto la buena suerte como la ciencia llevaron, en 1968, a la vinculación de este antígeno con la hepatitis vírica, un vínculo que transformó el estudio y el diagnóstico de la hepatitis, protegió el suministro de sangre, condujo a una vacuna contra la hepatitis B y culminó con el Premio Nobel en Medicina en 1976 para B. Blumberg por sus hallazgos sobre “el origen y diseminación de enfermedades infecciosas”.

Regresé a los NIH en 1969 para investigar las causas y la prevención de la hepatitis postransfusional y realizar investigaciones clínicas de la hepatitis B y sus antígenos asociados. No tenía ni idea de que esto sería un esfuerzo para toda la vida. Mi primera función fue continuar y ampliar los estudios prospectivos de la hepatitis postransfusional iniciados por John Walsh, Bob Purcell, Paul Holland y Paul Schmidt. Walsh y sus colegas ya habían demostrado el elevado riesgo de hepatitis ligado a la transfusión de sangre y, en particular, el riesgo asociado a los donantes remunerados.

En 1970, Holland, Schmidt y yo, en una reunión aún memorable que más tarde influiría en la política nacional para las transfusiones de sangre, decidimos que no se podía tolerar el uso continuo de donantes pagados y también concluimos que deberíamos introducir la detección de donantes de cara al futuro; luego llamado el antígeno asociado a la hepatitis. Luego hice simultáneamente un análisis retrospectivo que demostró el valor de realizar la prueba del antígeno de la hepatitis B en los donantes e inicié un nuevo estudio prospectivo para evaluar el efecto de este cambio en la aceptación de donantes. El resultado fue sustancial: la incidencia de hepatitis entre los pacientes sometidos a cirugía a corazón abierto disminuyó del 33% al 9,7%.

Calculamos que el principal determinante de esta reducción de alrededor del 70% fue la exclusión de donantes remunerados. De hecho, las pruebas retrospectivas de los marcadores del virus de la hepatitis B (VHB) mostraron que sólo el 20% de las hepatitis diagnosticadas antes de la detección de antígenos estaban relacionadas con el VHB. Por tanto, con esto se avanzó en el reconocimiento de la hepatitis no B asociada a transfusiones. Las pruebas para diagnosticar el antígeno de la hepatitis B en los donantes, llevaron a que la transmisión de la hepatitis B fuese casi cero en 1977.

En 1973, Steve Feinstone, que tenía la nada envidiable tarea de examinar muestras de heces (aguas fecales) en el edificio 7 de los NIH, utilizó microscopía electrónica inmunitaria para descubrir el virus de la hepatitis A, en colaboración con Al Kapikian y Bob Purcell. Inmediatamente al profundizar en nuestras investigaciones en los casos de hepatitis no B, nos sorprendió descubrir que ni un solo caso se debía al virus de la hepatitis A. En una incursión menos que brillante en la nomenclatura, designamos estos casos de hepatitis no A, no B (NANB). Bob Purcell, en particular, consideró que no se debería llamar al agente virus de la hepatitis C hasta que no se hubiese probado su transmisibilidad y hasta que no se hubiesen establecido el número de agentes que podrían estar involucrados. En nuestro optimismo, no sospechamos que la designación no A, no B persistiría durante 15 años antes de que pudiera definirse su etiología específica.

En 1975, mientras continuaban los estudios prospectivos, mi atención se centró en probar la transmisión de la hepatitis NANB en el modelo de chimpancé. Los primeros intentos de transmisión de chimpancés habían fracasado, pero pensando con lógica, razoné que se podrían usar muestras de nuestros estudios prospectivos, con inóculos en volúmenes equivalentes a las transfusiones de sangre en humanos. Logramos el éxito en nuestro primer intento, ya que cinco de los cinco chimpancés desarrollaron aumentos de la alanina aminotransferasa (ALT) en los intervalos apropiados después de la inoculación. Más tarde pudimos utilizar este mismo enfoque y lograr la primera transmisión animal experimental del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En ausencia de un sistema de cultivo de tejidos, una partícula observada o un ensayo serológico, la disponibilidad de un modelo animal era esencial para seguir estudiando el agente NANB. A lo largo de estos estudios prospectivos, mi principal colaborador fue Bob Purcell del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, quien proporcionó el brazo de investigación básica necesaria para impulsar las investigaciones del NANB. De entre los 50 casos de hepatitis NANB identificados en ese momento, seleccioné un paciente (H) que tenía una hepatitis NANB aguda particularmente grave y del cual habíamos obtenido unidades de aféresis mientras sus niveles de ALT estaban aumentando.

Purcell estableció una serie de titulación del plasma H y luego realizó estudios de infectividad en el chimpancé. H tenía un título de infectividad de 106,5 CID50 / ml (dosis infecciosas de chimpancé), lo que nos permitió luego realizar una serie de manipulaciones del virus y probar su efecto sobre la infectividad. Dichos estudios de Feinstone, He y otros demostraron que el agente NANB era sensible al cloroformo y tenía menos de 30 nm de diámetro, según estudios con filtros. Por tanto, el agente de la hepatitis NANB parecía ser pequeño, envuelto en lípidos, transmisible por sangre y responsable de la mayoría de los casos de hepatitis asociada a transfusiones que aún se producían. Posteriormente, Patrizia Farci de la Universidad de Cagliari, en colaboración con Purcell y yo, hicimos una serie de estudios con chimpancés en los que mezcló suero de fase crónica del paciente H con el inóculo infeccioso de fase aguda y estudió la infectividad del mezcla en el modelo de chimpancé. Estos estudios hicieron la importante observación de que se desarrollan anticuerpos neutralizantes contra el virus de la hepatitis C (VHC), pero son muy específicos de la cepa y, en la mayoría de los casos, incapaces de prevenir la aparición de variantes virales que conducen a una infección persistente.

A medida que se realizaban estos estudios virológicos e inmunológicos a fines de la década de 1970 y principios de la de 1980, mi objetivo principal era definir las consecuencias clínicas de la infección por el virus NANB y establecer un ensayo serológico para hacer en los análisis de sangre. El primero resultó más fácil que el segundo. La entidad NANB hepatitis inicialmente se encontró con un escepticismo considerable, y algunos creían que sólo causaba una transaminitis irrelevante, porque se había reconocido la enfermedad clínica en pocos pacientes. Sin embargo, a medida que monitoreamos a los pacientes a largo plazo y realizamos biopsias de hígado en colaboración con Jay Hoofnagle y el Servicio de Hepatología de los NIH, se hizo evidente que la mayoría de los pacientes infectados con NANB tenían evidencia bioquímica de hepatitis crónica, y que el 20% había progresado a cirrosis en el transcurso de una a dos décadas.

Posteriormente, tras el descubrimiento del VHC, ampliamos estos estudios de historia natural tanto en donantes asintomáticos como en receptores de transfusiones, estos últimos en colaboración con Leonard Seeff, y confirmamos que entre el 20% y el 30% de las personas infectadas por el VHC presentaban resultados histológicos graves. Sin embargo, y también fue importante, estos estudios mostraron que alrededor del 20% de las personas infectadas por el VHC experimentaban una recuperación espontánea y que en la mayoría tenía un curso indolente, quizás no progresivo. En colaboración con Farci y Purcell, también pudimos demostrar la diversidad viral (“cuasiespecies”) de la infección por VHC y que el grado de diversidad en la fase aguda de la enfermedad predecía si se produciría una infección crónica.

Los estudios histológicos que documentaron la progresión a la cirrosis hicieron que fuera aún más imperativo desarrollar un análisis de sangre. En la década de 1978 a 1988, intentamos todas las variaciones de los diversos enfoques serológicos para el desarrollo de posibles ensayos. A pesar de utilizar muestras “altamente infecciosas”, sueros “supuestamente convalecientes”, gammaglobulinas purificadas y los métodos de radioinmunoensayo más sensibles, no pudimos desarrollar una prueba serológica específica para este agente esquivo. En ausencia de un ensayo específico, buscamos marcadores “sustitutos” que pudieran identificar a los portadores del NANB.

El enfoque más lógico fue medir ALT. Aunque un análisis retrospectivo de las muestras prospectivas de las que disponíamos, mostró que los aumentos de ALT en el donante se correlacionaban con la transmisión de la hepatitis, pero no pudimos demostrar la eficacia de este ensayo “sustituto” en un estudio prospectivo posterior. Luego buscamos otras medidas de posible selección de los donantes y razonamos que los donantes que habían estado expuestos al VHB también podrían tener más probabilidades de haber estado expuestos a NANB; Era probable que dichos donantes se hayan recuperado de la infección por VHB y hayan pasado la prueba de detección de donantes, pero podrían ser portadores persistentes de NANB. Por lo tanto, utilizamos anticuerpos contra el antígeno del núcleo de la hepatitis B (anti-HBc) como índice de una infección anterior por VHB, y demostramos en un análisis retrospectivo de nuestra cohorte que los donantes con anticuerpos contra el HBc + tenían cuatro veces más probabilidades de transmitir una hepatitis NANB y que su exclusión podría prevenir el 30% de tales transmisiones.

Estos datos y los de un estudio colaborativo multicéntrico de virus transmitidos por transfusión convencieron a las principales organizaciones de sangre de implementar pruebas de anticuerpos anti-HBc y ALT en el cribado rutinario de donantes en 1987. Era difícil medir el efecto específico de estos ‘sustitutos’ como dice porque había surgido la amenaza del sida asociado a las transfusiones y los ensayos “sustitutos” se introdujeron junto con un interrogatorio más intensivo de los donantes sobre el comportamiento de alto riesgo y mediante un menor uso de sangre alogénica. No obstante, pudimos demostrar que estas medidas combinadas sirvieron para disminuir la incidencia de hepatitis al 4,5% en 1989. Los esfuerzos para desarrollar un ensayo específico para detectar el NANB continuaron durante la década de 1980, aunque el esfuerzo principal de Chiron se mantuvo oculto.

Durante este tiempo, había desarrollado un panel de sueros que consistía en muestras codificadas duplicadas que habían demostrado ser infecciosas en el chimpancé o no infecciosas en humanos. En 1989, muchos laboratorios diferentes afirmaron haber desarrollado un ensayo NANB y pidieron probar el panel. Ninguno pudo descifrar el código y justo en aquel momento, recibí una llamada de George Kuo del laboratorio Chiron, diciendo que ellos también creían que tenían un ensayo para la detección del NANB. Le envié a George los restos del panel de sueros ahora menguante y en unos días recibí sus resultados seguidos de varias llamadas ansiosas preguntándome si ya había descifrado el código. Cuando lo hice, me emocioné al descubrir que Chiron había detectado todos menos dos de los sueros infecciosos y había encontrado correctamente que todos los sueros no infecciosos eran negativos. Además, las dos muestras que pasaron por alto eran sueros de fase aguda, y las muestras posteriores de estos mismos pacientes demostraron ser positivas para lo que Chiron a partir de entonces llamó virus de la hepatitis C. Michael Houghton describió más adelante todos los eventos que precedieron a este descubrimiento.

Utilizando el ensayo recientemente desarrollado para anticuerpos contra el VHC, profundizamos nuevamente en el estudio de nuestras muestras y pudimos mostrar rápidamente que el 88% de los casos de hepatitis NANB se sero-convirtieron para anticuerpos contra el VHC, que el desarrollo de anticuerpos estaba en relación temporal con el curso de la hepatitis y que los pacientes infectados podrían estar vinculados a donantes infectados. Por lo tanto, en 1990 estaba claro que el VHC era el principal agente de la hepatitis NANB y se inició el cribado universal de donantes. Establecimos un nuevo estudio prospectivo para medir el efecto de tales pruebas y definir el alcance de la hepatitis residual no relacionada con el VHB o el VHC. El ensayo de primera generación de anticuerpos contra el VHC dio como resultado una disminución adicional del 70% en la incidencia de hepatitis postransfusión, hasta una tasa residual del 1,5%, y un ensayo de segunda generación más sensible, introducido en 1992, casi eliminó la transmisión del VHC. Aunque el modelo matemático indica que la sangre analizada con anticuerpos aún podría transmitir el VHC entre 1:100.000 a 1:200.000 de los receptores, la disminución observada del 33% en 1970 a casi cero en 1997 es un testimonio de la eficacia acumulada de una serie de pruebas de detección de donantes intervenciones basadas en pruebas. Las pruebas de ácidos nucleicos virales de los donantes y las tecnologías mejoradas de inactivación viral llevaron muy pronto a la disminución de la transmisión del virus de la hepatitis y de la inmunodeficiencia humana de casi cero a cero absoluto. Ahora estoy buscando otra línea de trabajo.

El virus de la hepatitis C: Un nuevo paradigma para la identificación y el control de las enfermedades infecciosas

Identificación del virus de la hepatitis C

El problema de la hepatitis no A, no B (NANB) surgió en 1975, después de que se desarrollaran las pruebas serológicas para el virus de la hepatitis A (VHA) y el virus de la hepatitis B (VHB). Entonces se hizo evidente que la mayoría de los casos de hepatitis después de la transfusión no se debían ni al VHA ni al VHB, y que el riesgo de hepatitis NANB después de las transfusiones de sangre era tan alto como el 10% o incluso mayor. Más tarde, también se hizo evidente que la hepatitis NANB se presentaba con frecuencia en forma de infecciones esporádicas adquiridas en la comunidad. Siguió un período frustrante de 13 años, en el que los métodos utilizados con éxito para identificar el VHA y el VHB no dieron como resultado la identificación molecular del agente o agentes etiológicos de la hepatitis NANB. No se identificó ningún antígeno, anticuerpo o sistema de cultivo celular específico de la hepatitis NANB, y esta falta de un “control” molecular limitó el progreso en la identificación de los agentes causantes de la hepatitis NANB. Sin embargo, se aprovechó un modelo de chimpancé desarrollado con éxito por varios grupos para demostrar que un agente antihepatitis NANB inducía túbulos membranosos característicos dentro del retículo endoplásmico de los hepatocitos de chimpancé infectados. Conocido como el agente formador de túbulos, más tarde se demostró que era filtrable y que perdía la infectividad después del tratamiento con disolventes orgánicos, de acuerdo con que era un virus envuelto en lípidos, posiblemente un virus similar a la toga o al flavi. Otros datos apoyaron la existencia de un agente de hepatitis NANB similar al VHB, así como un virus de hepatitis NANB resistente al cloroformo (sin envoltura) y posiblemente otros agentes de hepatitis NANB.

Finalmente, lo que resultó ser la forma principal de hepatitis NANB transmitida por vía parenteral se identificó utilizando un método de inmunocribado “ciego” aplicado a serotecas de ADNc de λgt11 recombinante preparadas a partir de ARN total y ADN extraído de plasma infeccioso de chimpancé.

El genoma del ARN también codificaba una poliproteína grande de aproximadamente 3.000 aminoácidos que tenía una identidad de secuencia primaria distante con miembros de la familia Flaviviridae. Por tanto, el VHC se identificó mediante la clonación molecular directa de su genoma en la relativa ausencia de conocimiento sobre la naturaleza del agente infeccioso y la respuesta inmune. Este método “ciego” podría ser útil en el futuro para descubrir otros agentes infecciosos desconocidos implicados en enfermedades. La identificación molecular del VHC fue la culminación de un esfuerzo de equipo que duró 7 años, durante los cuales se examinaron cientos de millones de clones de ADNc bacteriano para detectar un origen de hepatitis NANB putativo utilizando muchos enfoques diferentes. El enfoque exitoso involucró a Qui-Lim Choo en mi laboratorio en Chiron y los laboratorios de George Kuo (Chiron) y Daniel Bradley (CDC). Acepto el premio en nombre de estos colaboradores.

Propiedades del VHC

Ahora que se sabe que contienen un genoma de ARN muy variable, los VHC constituyen un género grande (el género hepacivirus) dentro de la familia Flaviviridae. Hasta ahora se han distinguido seis genotipos básicos, con más de 100 subtipos filogenéticamente distintos. En cualquier momento, el genoma viral existe como una cuasiespecie compleja. El genoma del ARN contiene un sitio de entrada del ribosoma interno en el extremo 5’ conservado que es responsable de iniciar la traducción de la poliproteína grande. Este último se escinde co y postraduccionalmente en al menos tres proteínas estructurales o viriónicas y siete supuestas proteínas no estructurales involucradas en la replicación del virus. El término 3 ‘del genoma del ARN está compuesto por una región variable, un tracto de polipirimidina y una estructura secundaria de tallo-asa muy conservada. Existen regiones hipervariables dentro del gran dominio de glicoproteína gpE2 que pueden estar bajo selección inmune. El virus C no crece eficazmente en cultivo celular o a partir de hígado o sangre infectados y, por tanto, todavía no se ha caracterizado morfológica o bioquímicamente.

Serodiagnóstico

La clonación molecular del genoma del VHC condujo a la disponibilidad de muchos antígenos para el diagnóstico del VHC. George Kuo los purificó y desarrolló numerosas pruebas de EIA experimentales que detectan anticuerpos contra el VHC. Este trabajo intensivo permitió la selección de epítopos inmunodominantes óptimos para su inclusión en una serie de pruebas de detección y diagnóstico de sangre sensibles y específicas para la infección por VHC; los cuales se utilizaron para examinar a los donantes de sangre a partir de 1990, estos análisis han llevado a la casi desaparición de la hepatitis C asociada a la transfusión. Desde la implantación de estas pruebas, sólo en los EEUU se han prevenido al menos 40.000 infecciones cada año. Estas pruebas también han sido de gran utilidad en el diagnóstico de pacientes con hepatitis y en su tratamiento clínico, y en la atribución de enfermedades hepáticas y extrahepáticas a la infección por VHC. La hepatitis crónica, la cirrosis hepática, el carcinoma hepatocelular, la crioglobulinemia y la porfiria cutánea son secuelas clínicas potenciales bien establecidas de la infección crónica por VHC. Otras enfermedades, como el liquen plano oral, el síndrome de Sjögren y el linfoma no Hodgkin, también se han relacionado con la infección por el VHC. Aunque la mayoría de las personas infectadas con el VHC tienen pocos síntomas clínicos y no progresarán a un estado de enfermedad grave, un subgrupo puede sufrir una enfermedad hepática progresiva en la que, a menudo durante décadas, la hepatitis crónica evoluciona a cirrosis hepática y a carcinoma hepatocelular (HCC). También pueden ocurrir manifestaciones extrahepáticas.

Recientemente, se han desarrollado varios ensayos de análisis de ácido nucleico, basados en el sitio de entrada del ribosoma interno 5’ altamente conservado y las secuencias del gen de la nucleocápsida, que pueden diagnosticar nuevas infecciones antes de que se produzca la seroconversión a anticuerpos anti-VHC. Disponer de estas pruebas basadas en los ácidos nucleicos, servirá para la detección de donantes de sangre y reducirá aún más el riesgo de contraer el VHC después de la transfusión (hasta aproximadamente uno de cada 300.000 en los EEUU, por ejemplo). Se dispone también de una prueba que detecta el antígeno de la nucleocápside circulante que también es valiosa para diagnosticar la infección antes de la seroconversión.

Educación, nuevas terapias y vacunas

Existen retos y necesidades no cubiertas tanto en los países desarrollados como en los menos desarrollados. En este último caso, la Organización Mundial de la Salud (OMS) recomendó la implantación mundial de la detección del VHC en donantes de sangre. En muchos países en los que el VHC es endémico, los riesgos de infección por VHC después de la transfusión siguen siendo excesivamente altos. Además, la OMS ha hecho hincapié en la educación para reducir los riesgos de transmisión del VHC en países desarrollados y en desarrollo. El uso histórico de jeringas y agujas no desechables ha sido la causa principal de la enorme carga de la enfermedad por el VHC presente en muchos países en desarrollo, así como de determinadas prácticas culturales (como la circuncisión) que implican el uso de equipos médicos no estériles. En los países desarrollados, el uso de drogas intravenosas que implica compartir agujas / jeringuillas sigue siendo el principal factor de riesgo. Se recomienda no realizar procedimientos que impliquen transferencia de sangre (como tatuajes con instrumentos compartidos). Los Centros para el Control de Enfermedades también recomiendan que las personas infectadas con el VHC no compartan cepillos de dientes, navajas de afeitar, etc.

Entre el 12% y el 50% de las infecciones agudas por VHC se resuelven espontáneamente sin progresar al estado de infección crónica que se asocia con las secuelas patogénicas de la infección. Tal resolución de la infección aguda se asocia con la inducción de respuestas amplias de linfocitos T citotóxicos y auxiliares al virus. Por tanto, la vacunación adecuada para preparar tales respuestas inmunitarias podría reducir la alta tasa de cronicidad asociada con la infección por VHC.

Finalmente, aunque el VHC es un virus RNA sin intermediarios de replicación de tipo DNA que puedan integrarse en el genoma del huésped, aún logra persistir en la mayoría de los casos (generalmente de por vida en individuos no tratados). Elucidar los mecanismos de persistencia representa el desafío más intrigante de la investigación futura del VHC.

 

Fuente: Nature

Referencia: Alter, H., Houghton, M. Hepatitis C Virus and eliminating post-transfusion hepatitis. Nat Med 6, 1082-1086 (2000). https://doi.org/10.1038/80394

Artículo traducido y adaptado por ASSCAT

*Nota de ASSCAT: Vale la pena leer este artículo en primera persona del Dr. Harvey Alter, publicado en el año 2000, para reflexionar sobre la tenacidad de este investigador en su búsqueda para evitar las hepatitis postransfusión, que ha llevado a la situación actual de poder curar una grave infección vírica, por primera vez en la historia, y que sus méritos hayan sido reconocidos con el Premio Nobel de Medicina en 2020, después de tantos años.

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